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Reacción en cadena de la polimerasa: qué es la PCR más allá de su uso por la COVID-19

Equipo de comunicación Aconsa

La reacción en cadena de la polimerasa, abreviada PCR por su nombre en inglés (Polymerase Chain Reaction) se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en laboratorio es muy habitual desde hace muchos años, para usos que van desde la secuenciación del ADN hasta la generación de perfiles de ADN forense a partir de muestras genéticas, pasando por la identificación de patógenos gracias a la detección de la ausencia o presencia de sus genes.

En este post explicaremos en qué consiste la reacción en cadena de la polimerasa, incluyendo sus principios y sus etapas, y para qué se usa, aparte de detectar la presencia del gen (ARN en este caso) del coronavirus SARS-CoV-2, que causa la COVID-19.

Una emulación de una actividad celular natural

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) nace de la dificultad de estudiar trozos de ADN aislados en análisis moleculares y genéticos que requieren cantidades significativas de material genético. La PCR permite “amplificar” o “fotocopiar” diminutos segmentos de ADN millones de veces, por lo que a menudo se habla de está técnica como uno de los avances científicos más importantes en biología molecular, que valió a su creador, Kary B. Mullis, el Premio Nobel de Química en 1993.

La PCR se basa en una actividad enzimática que en las células de nuestro organismo se produce de forma natural: las ADN polimerasas pueden obtener dos copias idénticas de las cadenas de ADN nuclear, que en la mitosis repartirán a las células hijas. De la misma manera, en está técnica las polimerasas (generalmente las denominadas Taq) podrán replicar, como una fotocopiadora, un fragmento de ADN, en varios ciclos (entre 20 y 35), que son cambios repetidos de temperatura, para obtener una gran cantidad de copias para poder analizar, en una reacción en cadena a la que debe su nombre.

Usos de la reacción en cadena de la polimerasa

Una vez amplificado, el ADN obtenido por PCR se puede usar en muchos procedimientos de laboratorio diferentes. Por ejemplo, la mayor parte de técnicas de mapeo del Proyecto del Genoma Humano se basaban en la PCR.

Además, también se usa para un sinfín de técnicas clínicas y de laboratorio habituales, incluidas las huellas digitales de ADN (pruebas de paternidad o análisis forenses, por ejemplo), detección de microorganismos (bacterias como Salmonella o Listeria en agua o alimentos, Legionella o agua, etc., virus como el sida, la hepatitis o el COVID-19) y el diagnóstico de trastornos genéticos.

Ventajas de la reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa tiene algunas ventajas significativas respecto a los tradicionales cultivos, que son el método que tradicionalmente asociamos a la microbiología: placas de petri y tubos de ensayo colocados en estanterías, microscopio, colocación de los tejidos en placas de cultivo que se introducen en una incubadora y esperar a ver qué crece, de forma lenta pero segura. A menudo este proceso implica ensayo-error, descartando especie tras especie hasta que solo queda una, a través de la observación de sus características y su comportamiento. Por ejemplo, la E. coli y la Pseudomonas aeruginosa tienen células gramnegativas en forma de bastoncillo, por lo que observadas con microscopio se ven similares, pero sólo mediante un cultivo se puede comprobar que la E. coli metaboliza la lactosa.

Sin embargo, las pruebas moleculares como la PCR han aportado algunas ventajas a las pruebas de cultivo. Las principales son:

Qué se necesita para llevar a cabo una PCR

Una plantilla de ADN: en primer lugar se necesita el ADN que se debe copiar, que generalmente se extrae y se purifica de la sangre o de otro tejido.

Cebadores o iniciadores (primers, en inglés): se trata de oligonucleótidos monocatenarios que se unen a la plantilla de ADN por los extremos y sirven para que la polimerasa inicie la reacción para empezar a sintetizar el material genético. Se necesitan dos cebadores para la PCR, cada uno de ellos complementario a una cadena de ADN que queremos amplificar, y delimitan la zona del ADN a amplificar, es decir, que corresponden a:

Además de todos estos ingredientes, la reacción en cadena de la polimerasa implica un proceso de cambios de temperatura (los ciclos) que tienen lugar en un equipo llamado termociclador, que se programa para alterar la temperatura de la reacción cada pocos minutos para permitir la desnaturalización y síntesis del ADN, de manera que el proceso completo finalice en unas pocas horas.

Etapas de la PCR

1. Desnaturalización del ADN

Es el momento en el que la plantilla de ADN de doble cadena se calienta para separarlo en dos cadenas simples.

¿Qué ocurre en esta etapa?

2. Alineación del ADN

Durante esta etapa, se baja la temperatura para permitir que los cebadores (primers) de ADN se adhieran a la plantilla de ADN.

¿Qué ocurre en esta etapa?

3. Ampliación del ADN

Es el paso final, la parte en la que la temperatura aumenta y la nueva cadena de ADN es producida por la enzima polimerasa Taq.

¿Qué ocurre en esta etapa?

Repeticiones

La reacción en cadena de la polimerasa requiere repetir estos tres procesos o ciclos térmicos de 20 a 40 veces, duplicando el número de copias de ADN cada vez.

¿Qué ocurre en cada repetición?

Tipos de reacción en cadena de la polimerasa

Hoy en día existen numerosas variaciones de la reacción en cadena de la polimerasa, según el objetivo y los requisitos que se tenga. Las más habituales son:

PCR anidada

Está variación de la reacción en cadena de la polimerasa se usa cuando se quiere incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Por eso se duplica el paso de la amplificación con distintos pares de primers en cada uno. Primero se lleva a cabo una reacción en cadena con los cebadores externos para amplificar la parte más extensa de ADN, que contiene el segmento que tenemos por objetivo, y luego está amplificación se usa como ADN plantilla de una segunda PCR con cebadores internos para copiar ese segmento específico.

PCR in situ

Se suele usar para detectar cadenas de ADN dentro de células que con otras técnicas no se pueden detectar, por lo que se hace en tejidos. En contrapartida tiene menor capacidad de amplificación.

PCR múltiple

En esta variante se usan varias parejas de cebadores en una misma reacción en cadena para varias ampliaciones. Cada pareja corresponde a un virus distinto, y así se puede detectar una misma reacción de varios patógenos a la vez, como por ejemplo diferentes virus respiratorios.

RT-PCR (con transcriptasa inversa)

Es la que se lleva a cabo en el diagnóstico de virus como el SARS-CoV-2 que causa la COVID-19. Este tipo de PCR es necesario para virus que tienen genoma de ARN, que requieren un paso adicional en el proceso: después de aislar y purificar el ARN, se usa la transcriptasa inversa (llamada también RT, por sus siglas en inglés, Reverse Transcription) para sintetizar una molécula de ADN complementario que sirve de inicio para la PCR convencional.

Consta, por lo tanto, de tres pasos:

PCR en tiempo real o cuantitativa

La ventaja principal de esta PCR es que permite monitorizar (medir) en tiempo real la cantidad de fragmentos de material genético que se van produciendo, es decir, durante cada ciclo de amplificación, y no al final, sin sacrificar la precisión. Se requieren reactivos fluorescentes y un termociclador que mide la fluorescencia en un momento concreto de cada ciclo de amplificación. Esto es especialmente interesante si lo que se desea testar es un microorganismo en alimentos muy perecederos o de vida útil corta.

PRC de células viables.

Como paso previo a la amplificación del fragmento de ADN diana, la muestra se somete a una neutralización del material genético “libre” en la suspensión, o el procedente de células dañadas o muertas. Con este paso inicial, los resultados de la PRC evidenciarán solamente la presencia de células vivas presentes en nuestra muestra.

Aconsa, laboratorio especializado en PCR alimentarias y de aguas

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